第3章 人卵泡的体外培养(3)

分离巢中卵泡的方法

卵巢中分离得到的早期卵泡也可以用来做体外培养的研究。目前分离卵泡主要有两种方法,即机械法(显微解剖法)和酶消化法。

用酶部分或者完全消化卵巢组织后就可以分离卵泡,所用的酶有蛋白水解酶如胶原酶(collcollagenase、胶原酶Ⅱ或区(45,47,6364),也可以用胶原酶结合脱氧核糖核酸酶( deoxyribo-nuclease)(47)和释放酶( liberase)(65)。

机械法分离卵泡就是用细针将含有紧密纤维的卵巢间质组织切割,使卵泡分离出来。经酶部分消化后的卵巢组织再用机械方法分离卵泡往往更容易。但不管酶消化还是　机械法都有一定局限性。

由于大型哺乳动物卵巢间质　含有纤维,使得机械法分离卵泡费力费时,而且机械法　分离的卵泡存活率一般很低。酶消化法主要的缺点是破坏卵泡的完整性,经常使基底膜( basal membrane)和膜细胞( theca cell)破裂从而导致卵丘卵母细胞通讯及物质交换受阻,而且这种破坏经常使体外培养的卵泡发育力低下。

虽然卵泡分离存在很多不足之处,但培养分离的卵泡意义重大。分离卵泡的培养可以帮助　我们了解在卵巢组织中卵泡的物质组成,还可以避免培养没有卵泡的卵巢皮质薄片。

但要证实在人和大型　动物卵巢中分离卵泡的安全性是一项艰难的工作。

目前,只是在啮齿类动物模型——小鼠中验证了分离卵泡的安全性。经酶消化法(66)或机械法(67)分离的小鼠次级卵泡均能在体外培养得到具有发育潜力的成熟卵子,并最终得到了活产的小鼠幼崽。

卵泡培养的方法

通过卵泡培养方法的调整和完善,卵泡培养得到小鼠成熟卵子并形成胚胎,且有足月小鼠出生的报道(66~68)。遗憾的是,人和大型动物卵泡培养方法的研究进展缓慢。卵泡培养方法的选择根据物种的自然属性而定,目前卵泡培养基本上从三个途径进行,即卵巢皮质的培养(人和大型动物)、整个卵巢的培养(啮　齿类动物)和分离卵泡的培养(人,大型动物和啮齿类动物)。在卵巢皮质培养中,经常将卵巢皮质组织切割成厚度为0.1~1mm,面积为1mm2的薄片进行培养(12~14,18,61~71)。这样大小的薄片增加了面积与体积比,使组织与培养液能更好进行物质交换,且便于组织的气体交换(72)。几种不同的基础培养液被用于人和其他动物的卵巢皮质组织和分离卵泡的培养(见表3.1和表3.2),BSS( balanced salt solution)、Mm( Iscove's' modified Dulbecco's' medium)、AIM-V溶液用于人卵泡的培养(12,70,71);aMEM( minimum essential medium alpha)和d-mem(d-mini

mum essential medium)用于人(27,46,47)、小鼠(67)、牛(21)和绵羊(20)卵泡的培养; Waymouth液体用于人(16)、小鼠(66)、牛(22)、猪(57)和狒狒(23)卵泡的培养。

在卵泡体外培养中,胰岛素、转铁蛋白、硒(insu-lin, transferrin, and selenium, ITS　或与人血清白蛋白和再(或)血清是卵泡体外培养液的主要添加物,添加这些是物质的目的是促进卵泡代谢和提高激素活性。

培养所质用的培养皿从简单的试管到塑料质地的培养板不尽相同(16,18)。培养板或包被(12,16,17,24,72)或不包被(12,46)组织培养嵌合物。这些嵌合物一般由细胞外基质( extracellular matrix,ECM)化合物组成,包括型胶原(63)或层粘连蛋白、Ⅳ型胶原和蛋白聚糖的混　合物(12),或I型、Ⅲ型胶原混合物(73)。

此外,琼脂(47)、胶原凝胶和藻酸盐细胞外基质凝胶(74)也被用　于分离卵泡的培养。添加这些物质的目的是为卵泡体　外培养提供一个三维组织培养体系,促进卵泡细胞聚　集,使培养体系更接近卵泡的体内生长环境,以便更好地维持卵泡生理控制功能。“静止”的原始卵泡从卵巢间质中分离出来后还没有成功的培养方法,培养整个卵巢组织的方法也只在卵巢体积较小的动物中开展,如啮齿类动物(32,35~37,44,66),该方法的主要途径就是激活卵巢中“静止”原始卵泡使其生长。

分离卵泡的培养研究限定在初级和次级卵泡(secondaryfollicle)上,这些卵泡已经从人(45~47)、山羊(48)、绵羊(49~51)、牛(52~56)、猪(57~59)和啮齿类动物(25,66~68,74~80)中成功分离,并在体外发育到各个阶段。

(来源：《不孕症与辅助生殖》)